Флуоресцентные метки и красители: как выбрать подходящий

Начинающий исследователь обычно выбирает краситель по цвету: «нужен зелёный для белка и синий для ядра». Опытный смотрит на спектр возбуждения, спектр эмиссии, квантовый выход, фотостабильность и совместимость с фиксацией — и только потом на цвет.

Разница между этими подходами измеряется неделями переделанных экспериментов. Разберём, из чего складывается осознанный выбор флуоресцентной метки.

Классификация флуорофоров и красителей: органические и неорганические

Все флуорофоры работают по одному принципу: поглощают фотон одной длины волны и переизлучают более длинноволновый. Разница между спектрами возбуждения и эмиссии называется стоксовым сдвигом, и чем он больше, тем проще развести два потока фильтрами. Различаются же метки по природе.

Органические красители малых молекул. Самый массовый класс. К нему относятся флуоресцеины, родамины, цианиновые красители, семейства современных синтетических меток. Сильные стороны — небольшой размер, богатый выбор спектров, отработанная химия конъюгации с антителами. Слабая — умеренная фотостабильность: под возбуждающим светом молекула необратимо разрушается.

Красители, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами. Отдельная подгруппа: одни интеркалируют между основаниями ДНК, другие садятся в малую бороздку. Дают яркий сигнал ядра при простом протоколе. Требуют осторожности: многие из них мутагенны, работать с ними следует в перчатках.

Неорганические метки — квантовые точки. Полупроводниковые нанокристаллы. Обладают исключительной яркостью и фотостабильностью, широким спектром возбуждения и узким, симметричным спектром эмиссии, зависящим от размера частицы. Это делает их удобными для многоцветности: одним источником возбуждаются все, а каналы почти не перекрываются. Ограничения — крупный размер, затрудняющий проникновение в клетку, склонность к мерцанию и вопросы к цитотоксичности.

Генетически кодируемые флуоресцентные белки. Метка синтезируется самой клеткой как часть исследуемого белка. Незаменимы при работе с живыми объектами и динамикой, но уступают синтетическим красителям в яркости.

Лантанидные комплексы. Обладают длительным временем жизни возбуждённого состояния, что позволяет уйти от короткоживущей автофлуоресценции ткани, регистрируя сигнал с задержкой.

Подбор красителей в зависимости от объекта исследования

Объект диктует выбор жёстче, чем предпочтения исследователя.

• Фиксированный препарат, иммунофлуоресценция. Подойдут органические красители: конъюгаты с вторичными антителами отработаны и доступны. Фотостабильность здесь менее критична, чем при длительном наблюдении.
• Живая культура, длительное наблюдение. Флуоресцентные белки или яркие фотостабильные красители с высоким квантовым выходом — они дают тот же сигнал при меньшей дозе света, а значит, меньше повреждают клетку.
• FISH и гибридизация зондов. Требуется стабильность каналов и точное совмещение сигналов. Красители подбирают с максимально разнесёнными спектрами эмиссии.
• Ткани с высокой автофлуоресценцией. Коллаген, эластин и особенно липофусцин светятся сами, преимущественно в зелёной области. Метку смещают в красную или дальнюю красную зону либо используют лантаниды с временным разрешением.
• Слабо экспрессируемая мишень. Нужна максимальная яркость: квантовые точки или системы усиления сигнала.

Оптика обязана соответствовать выбранной метке. Современные объективы с полностью скомпенсированными сферическими и хроматическими аберрациями работают от ультрафиолета до ближнего инфракрасного и специально чувствительны к спектру эмиссии люминесцентных красителей. Другие серии объективов обеспечивают плоское изображение при высокой светопропускаемости либо рассчитаны на светлое поле и флуоресценцию голубого и синего свечения — стандартный выбор клинической лаборатории.

Проверить совместимость объективов, фильтров и камеры с вашим протоколом помогают специалисты, которые подберут флуоресцентный микроскоп в подходящей конфигурации, а при иных требованиях предложат оптику различных производителей.

Особенности многоцветной флуоресцентной микроскопии

Многоцветность — то, ради чего метод обычно и выбирают. Она же источник большинства ложных выводов.

Главная опасность — перетекание сигнала между каналами. Спектры эмиссии органических красителей асимметричны и имеют длинный «хвост» в красной области. Хвост зелёного красителя попадает в красный канал, и на изображении возникает ложная колокализация: кажется, что две молекулы находятся в одной точке, тогда как это один краситель, увиденный дважды.

Что с этим делают:

• подбирают пары флуорофоров с максимально разнесёнными спектрами эмиссии;
• обязательно ставят контроли с одиночным окрашиванием — препарат, где присутствует только один краситель, показывает величину перетекания;
• регистрируют каналы последовательно, а не одновременно;
• используют квантовые точки с узкой симметричной эмиссией там, где нужно много каналов;
• применяют качественные фильтры — покрытие флуоресцентных фильтров устраняет до 99 % фонового излучения, обеспечивая точный цветовой анализ.

Не менее важна воспроизводимость условий съёмки. Восьмипозиционная турель с быстрой сменой фильтра позволяет пройти все каналы, не трогая препарат. Кодированные револьверные головки в совокупности с турелью фиксируют, какой объектив и какая позиция турели использованы в любой момент исследования, и записывают это в данные полученного изображения — при разборе результатов через полгода такая мелочь оказывается решающей. Система автоматической регулировки яркости при смене увеличения снимает лишнюю засветку.

Стабильность и совместимость флуорофоров с методами фиксации

Последний, самый недооценённый этап. Метка может быть идеально подобрана и погибнуть на пробоподготовке.

Формалиновая фиксация усиливает автофлуоресценцию тканей и маскирует часть эпитопов. Парафиновые срезы требуют процедуры демаскировки антигена, а она, в свою очередь, способна повредить некоторые метки — поэтому конъюгированное антитело добавляют после демаскировки, а не до неё.

Спиртовая фиксация сохраняет часть эпитопов лучше формалина, но хуже сохраняет морфологию.

Флуоресцентные белки плохо переносят жёсткую фиксацию и органические растворители: сигнал попросту теряется.

Фотовыцветание продолжается и после окрашивания. Готовый препарат хранят в темноте и холоде, заключают в среду с антифединг-агентом, замедляющим разрушение флуорофора, и снимают как можно раньше.

Практические рекомендации сводятся к нескольким правилам. Планируйте протокол от метки к фиксации, а не наоборот. Ставьте контроль без первичного антитела, контроль без красителя и контроли с одиночным окрашиванием — три стекла, которые экономят месяц работы. Минимизируйте экспозицию: кнопка сохранения кадра, установленная на раме микроскопа рядом с ручкой фокусировки, позволяет снять изображение, не отвлекаясь на мышь, пока сигнал ещё яркий. И помните, что ни один флуорофор и ни один микроскоп не отменяют фотовыцветания, автофлуоресценции и спектрального перекрытия — их учитывают при постановке эксперимента, а не при интерпретации готовых картинок.